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避免RNA降解的注意事項

1. 使用正確的細胞或組織儲存條件 

在樣品用液氮瞬間凍結之后，應該儲存在-80°C，千萬(wàn)不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會(huì )導致 RNA 的降解和損失。瞬間凍結的組織應該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。RNAfixer 使樣品儲存更為便利。儲存在 RNAfixer 中的細胞或組織可在室溫下穩定保存長(cháng)達 1 個(gè)星期，在 4°C 可穩定保存長(cháng)達1 個(gè)月，或**保存在-20°C。 

2. 消除環(huán)境 RNase 的污染 

為了得到完整的、高品質(zhì) RNA，在整個(gè) RNA 制備過(guò)程中，當 RNA 離開(kāi)強蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護時(shí)，避免引入新的 RNase 污染就非常關(guān)鍵。由于 RNase 幾乎是**，所以必須確保與純化的 RNA 接觸的每一樣東西都是無(wú) RNase 污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺、玻璃器皿和制膠設備，都必須用表面去污凈化溶液如 RNase 噴霧清除劑來(lái)處理過(guò)，去除各種溶液或者反應緩沖液中可能存在的 RNase 污染，可以用 RNAsafe。必須保證一直使用無(wú) RNase 的槍頭、試管和溶液，手套也應經(jīng)常更換。 

3. 迅速滅活內源的 RNA 酶，以防止 RNA 降解 

以下 3 個(gè)方法均可有效使內源 RNA 酶失活： 

1）用含離液（如胍鹽）的細胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。 

2）用液氮瞬間凍結樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間

就能凍結，以確保瞬間令 RNA 酶失活。 

3）立即將樣品置于 RNAfixer 無(wú)液氮 RNA 樣品儲存液中。它是一種水相、無(wú)毒的收集試劑，

能立即穩定并保護完整、未凍結的組織和細胞樣品中的 RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm），這樣 RNAfixer 才能在 RNase 破壞 RNA 之前迅速滲入組織塊中。                                               

4.選擇合適破壁方法 

細胞或組織的*勻漿對 RNA 提取來(lái)說(shuō)，是一個(gè)很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止 RNA 的損失和降解。勻漿的方法應根據細胞或組織的類(lèi)型來(lái)選擇。大部分培養的細胞可以置于細胞裂解液中，通過(guò)簡(jiǎn)單的渦旋震蕩來(lái)勻漿；而動(dòng)物組織、植物組織、酵母和細菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說(shuō)細菌（特別是革蘭氏陽(yáng)性菌）的細胞壁，就需要溶菌酶消化來(lái)實(shí)現*的細胞裂解和 RNA 的最大回收，酵母提取時(shí)加入破壁酶幫助破壁。 

5.選擇最適 RNA 提取試劑（盒） 

現有眾多的 RNA 分離方法也許令人難以取舍。目前**也是**的方法是柱式分離，也就是結合基于 Trizol 原理的裂解液和硅膠膜吸附柱的使用，是目前比較通用的一種方法。

對于動(dòng)物細胞，組織，植物葉片等常用材料都基本適用。植物 RNA 的提取比較難抉擇，像根和果實(shí)等，由于多糖，多酚物質(zhì)的存在，很難純化；還有就是血清等液體樣本的提取，水分多或者 RNA 含量少等，較難提取?？梢圆捎冕槍π缘脑噭ê校?nbsp;

6. 低濃度 RNA 的沉淀 

純化得到的 RNA 可能需要通過(guò)沉淀來(lái)濃縮，以滿(mǎn)足一些下游應用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加 0.1 體積的 5M  醋酸銨、2-2.5 體積的無(wú)水乙醇，-20°C 放置 25 分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如  linear acrylamide 糖原 glycogen,酵母 yeast  RNA）的方法。核酸助沉劑是 linear  acrylamide，當RNA 用于 RT-PCR 分析時(shí)，線(xiàn)性的丙烯酰胺和 DNase 處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因為它們都不含 DNA 污染，糖原含量高會(huì )抑制 PCR 反應，應注意控制濃度，核酸助沉劑對 PCR 無(wú)影響，成為病毒核酸提取的**。酵母 RNA 和未處理的糖原會(huì )給樣品帶來(lái)核酸污染，有可能影響 RT-PCR 的結果。沉淀后，注意避免 RNA 沉淀過(guò)分干燥，因為這可能導致很難重新溶解。 

7.提取好的 RNA 如何儲存 

RNA 最好是提取完成后，立刻進(jìn)行下游實(shí)驗。如果只是短期儲存，重懸的 RNA 應放置于-20°C；如果是長(cháng)期儲存的話(huà)，就應該放置于-80°C。儲存 RNA 時(shí)，可以加入少量的 RNA酶抑制劑防止 RNA 的降解。 

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