液相色譜不能這么用/液相色譜錯誤使用方法盤(pán)點(diǎn)

上海連橋生物科技有限公司

液相色譜對于多數人來(lái)說(shuō)都是很好上手的儀器了，但是就算是用過(guò)幾年、經(jīng)驗豐富的分析員都會(huì )習慣于一些錯誤的操作，經(jīng)常導致一些儀器故障。

有時(shí)候為了求快會(huì )忽略一些步驟，殊不知往往得不償失！哪些操作不能做？哪些懶兒不能偷？那些小概率的故障師傅沒(méi)教怎么辦？液相使用過(guò)程中有哪四大關(guān)鍵因素要注意？

1. 流動(dòng)相不過(guò)濾

因為塵?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì )磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應預先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過(guò)，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經(jīng)常清洗或更換。

2. 使用后沒(méi)有及時(shí)清洗泵

流動(dòng)相不應含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應保留在泵內，尤其是在停泵過(guò)夜或更長(cháng)時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。

因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

3. 流動(dòng)相走空

泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jì)鹊牧鲃?dòng)相被用完，否則空泵運轉也會(huì )磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，終產(chǎn)生漏液。

4. 沒(méi)有流動(dòng)相流出，又無(wú)壓力指示

可能是泵內有大量氣體，這時(shí)可打開(kāi)泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個(gè)50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。

5. 壓力和流量不穩

原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時(shí)可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時(shí)，可卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。

6. 壓力為啥過(guò)高或過(guò)低

可能是是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)應逐段進(jìn)行。

在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，必須充分重視：

PS：（在液相色譜中對組分復雜的樣品采用梯度洗脫的方法。在同一個(gè)分析周期中，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，稱(chēng)為梯度洗脫。從而可以使一個(gè)復雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。

7. 梯度洗脫的流動(dòng)相選擇不當

要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。

當有機溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。

8. 忽略的空白梯度洗脫

梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質(zhì)峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì )被強溶劑洗脫下來(lái)。

用于梯度洗脫的溶劑需*脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。

9. 忽略了溶劑混合所帶來(lái)的粘度變化

混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱能承受的大壓力。

10. 關(guān)于六通閥的正確使用和維護

①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45μm濾膜過(guò)濾，以減少微粒對進(jìn)樣閥的磨損。

②轉動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過(guò)泵的大壓力；再轉到進(jìn)樣位時(shí)，過(guò)高的壓力將使柱頭損壞。

③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結束后應沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。

11. 關(guān)于色譜柱的使用和維護

色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會(huì )降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護色譜柱。

12. 調節流速太快

避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì )影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì )沖動(dòng)柱內填料，因此在調節流速時(shí)應該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。

13. 反沖色譜柱

一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì )迅速降低柱效。

14. 預柱和保護柱

選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預先被硅膠“飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進(jìn)行預處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。

15. 液相色譜在使用過(guò)程中四大關(guān)鍵因素

① 液相色譜儀本身：

對于儀器本身一般不會(huì )有問(wèn)題，特別是剛買(mǎi)回來(lái)的新儀器。對于儀器本身重要的就是儀器的校驗，剛買(mǎi)回來(lái)的儀器一般都是由賣(mài)家先對儀器做系統的確認工作（包括IQ、PQ、OQ），確認順利通過(guò)后，再請國家或省級儀器檢定局的來(lái)校驗，檢定合格后就可以放心使用了，除此之外，一些做得好的公司每半年會(huì )對儀器進(jìn)行一次的內部校驗，目的就是為了保證儀器的正?？蛇\行狀態(tài)。

② 色譜條件：

色譜條件一般包括流動(dòng)相、色譜柱、檢測波長(cháng)、流速及進(jìn)樣量。

流動(dòng)相就涉及到配制流動(dòng)相所用到的水和試劑試液，水一般要求用超純水或其他水的電阻率不大于18.2兆歐級別，試劑試液要求用色譜級別的，原因為防止水和試劑試液中的雜質(zhì)對色譜結果的干擾。

色譜柱會(huì )因不同的品種而有不同的要求，但每根色譜柱都有它的清洗要求，這個(gè)在色譜柱說(shuō)明書(shū)上都可以找到，一定要根據上面的要求進(jìn)行，否則會(huì )造成色譜柱效下降和色譜柱的使用壽命縮短，檢測波長(cháng)也會(huì )因品種的不同有不同的要求，這里需要指出的是要注意觀(guān)察檢測器氘燈能量的變化，比如基線(xiàn)波動(dòng)大，活性成分的響應值突然變小等，都有可能是氘燈的能量不足所引起的，氘燈一般建議使用800小時(shí)，但實(shí)際上使用時(shí)間不止，可根據實(shí)際情況更換。

流速也因品種的不同而不同，一般為1.0ml/min，流速是不可隨意改動(dòng)的，特別是作為QC人員，但是作為研發(fā)人員，有時(shí)為了摸索條件或進(jìn)行方法耐用性驗證，會(huì )對流速進(jìn)行改變以評價(jià)方法的適用性。對于進(jìn)樣量因不同的品種也有不同規定，進(jìn)樣量這塊現在都使用自動(dòng)進(jìn)樣，所以進(jìn)樣精密度都很好，不需強調什么。

③ 操作人員：

首先，作為液相操作人員，一定要認真學(xué)習夜想的說(shuō)明書(shū)，掌握液相硬件和軟件的操作，掌握日常的維護保養，掌握基礎故障的排除和維修。

一般液相的操作規程也是有操作人員起草的，所以只要嚴格按照操作要求進(jìn)行操作，一般不會(huì )出現問(wèn)題，當然啫喱需要特別指出的是對于液相的日常維護保養很重要，比如流動(dòng)相的過(guò)濾、脫氣、泵密封墊的清洗、系統管路的清洗、溶劑過(guò)濾頭的清洗等，倘若不堅持，很容易導致色譜柱堵塞、系統壓力過(guò)大、譜峰異常等不必要的故障，浪費時(shí)間。

其次，操作人員在配制液相分析用樣品溶液時(shí)，建議由同一個(gè)人單獨完成，以免不必要的偶然誤差。

④ 液相安裝環(huán)境：

液相色譜儀應盡量安裝于水平、遠離振動(dòng)、電磁干擾的屋內的臺面上，有條件的話(huà)盡量將液相數據處理系統分隔開(kāi)，一個(gè)是防止色譜基線(xiàn)噪音偏大，基線(xiàn)不穩等，一個(gè)是為減少對人體的危害。

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